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新物體識(shí)別測試是一種常用于研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知功能和記憶能力的方法。它為探索亨廷頓病、阿爾茨海默癥和精神分裂等神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制提供了重要線索。《Science》雜志曾發(fā)表多篇文章，利用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)來評估實(shí)驗(yàn)小鼠在不同研究背景下的記憶能力和認(rèn)知功能。
比如這項(xiàng)研究，闡釋了睡眠狀態(tài)重塑記憶的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，為臨床治療與睡眠相關(guān)疾病提供有力支持。實(shí)驗(yàn)者貫穿全文所采用地檢測實(shí)驗(yàn)小鼠記憶能力的方法--新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。
（圖源: Izawa S, et al. , Science. 2019 Sep 20;365(6459):1308-1313.）
新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)簡單，但仍對新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)知識(shí)了解不全面，本期內(nèi)容就對新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)做一個(gè)全面的介紹。
01 簡介
新物體識(shí)別測試（ORT）是一種常用的行為測定方法，用于深入研究小鼠學(xué)習(xí)和記憶的不同方面。該測試的流程簡單，包括適應(yīng)日、訓(xùn)練日和測試日，整個(gè)過程通常在三天內(nèi)完成。在訓(xùn)練階段，小鼠有機(jī)會(huì)探索兩個(gè)相同的物體，而在測試日，其中一個(gè)物體被替換為一個(gè)全新的物體。由于小鼠天生對新奇事物的偏好，它們通常會(huì)更多地探索新的物體，而不是已知的物體，這使得測試變得相對簡單，無需使用積極或消極的強(qiáng)化方式，也無需進(jìn)行長時(shí)間的訓(xùn)練計(jì)劃。 此外，ORT具有靈活性，可以根據(jù)研究需求進(jìn)行調(diào)整?？梢酝ㄟ^調(diào)整保留間隔時(shí)間來評估不同類型的記憶，如短期記憶或長期記憶。研究人員還可以在不同時(shí)間點(diǎn)使用藥物干預(yù)，包括訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或回憶前，以研究不同學(xué)習(xí)階段的影響，包括獲取、早期鞏固或回憶?？傮w而言，ORT是一種相對簡單、高效的小鼠記憶測試方法，可用于檢測在藥理學(xué)、生物學(xué)或遺傳學(xué)操作后引起的神經(jīng)心理變化。
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02 應(yīng)用領(lǐng)域
1.藥物研究：科學(xué)家常使用新物體識(shí)別測試來評估藥物對認(rèn)知功能的影響。例如，一些藥物可能會(huì)增強(qiáng)動(dòng)物對新奇刺激的識(shí)別能力，這暗示著它們可能具有潛在的認(rèn)知增強(qiáng)效果。 2.神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究：在研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病時(shí)，新物體識(shí)別測試有助于揭示與認(rèn)知功能受損相關(guān)的行為表現(xiàn)，這為理解疾病的病理生理機(jī)制提供了線索。 3.基礎(chǔ)研究：新物體識(shí)別測試也常用于基礎(chǔ)研究，以探索動(dòng)物的記憶和認(rèn)知機(jī)制，以及這些機(jī)制如何受到各種因素的影響。這有助于我們更深入地了解認(rèn)知過程的基本原理。
03 原理
在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，利用嚙齒類動(dòng)物對新奇物體的偏好，作為一種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，來評估它們的學(xué)習(xí)和記憶能力。這種實(shí)驗(yàn)無需動(dòng)物進(jìn)行特殊的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，也無需禁食禁水，而且不涉及懲罰或獎(jiǎng)賞刺激，因此動(dòng)物受到的應(yīng)激較小。與人類的再認(rèn)記憶檢測相似，這種方法被廣泛應(yīng)用，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。
04 實(shí)驗(yàn)裝置
1.封閉環(huán)境
根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，實(shí)驗(yàn)通常在一個(gè)封閉的方形或矩形容器中進(jìn)行，以確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間不受外部干擾。這些容器由賽昂斯提供，適用于不同大小的小鼠，既給予動(dòng)物足夠的活動(dòng)空間，又限制了它們的活動(dòng)范圍，以便觀察和記錄它們的行為。
容器： 小鼠：底面 40×40cm 的正方形，色澤灰色，四周有墻壁，壁高 40cm 大鼠：底面 72×72cm 的正方形，色澤灰色，四周有墻壁，壁高 50cm
2.地板和墻壁 為了避免干擾動(dòng)物行為觀察，實(shí)驗(yàn)環(huán)境的地板和墻壁通常選擇均勻的、不引人注意的顏色，如灰色或白色。 3.兩個(gè)相似物體 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，通常會(huì)在環(huán)境中放置兩個(gè)相似的物體，以幫助動(dòng)物熟悉環(huán)境。這些物體的形狀、顏色和大小都應(yīng)該相似，以確保它們在外觀上難以區(qū)分。 4.新物體 在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)，其中一個(gè)相似物體會(huì)被一個(gè)新的未知物體替換。新物體可能與原始物體相似，但通常在形狀或紋理上有一些差異，以引起動(dòng)物的注意。 5.觀察窗口 實(shí)驗(yàn)裝置的一側(cè)通常設(shè)有透明的觀察窗口，以便實(shí)驗(yàn)者觀察動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的行為，而不會(huì)干擾它們的正?；顒?dòng)。 6.光照條件 為了確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間對環(huán)境的感知不受光照影響，光照條件通常是均勻的。柔和的環(huán)境光被使用，以避免強(qiáng)烈的陰影。 7.攝像設(shè)備 為了記錄動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中的行為，通常會(huì)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安裝攝像設(shè)備。這些設(shè)備可用于后續(xù)的視頻分析，以獲取更詳細(xì)的行為數(shù)據(jù)。
05 實(shí)驗(yàn)步驟
1.準(zhǔn)備階段：在測試前，為了消除小鼠的陌生感，每天都對小鼠進(jìn)行撫摸，以避免在操作時(shí)對小鼠產(chǎn)生刺激。 2.第1階段，適應(yīng)期：小鼠在沒有放置任何物體的實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)自由運(yùn)動(dòng)10分鐘。這一階段相當(dāng)于對小鼠進(jìn)行了一種訓(xùn)練，以確保它們適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。 3.第2階段，熟悉期：在實(shí)驗(yàn)裝置中放入兩個(gè)相同的物體（標(biāo)記為AB），物體之間距離為10厘米，小鼠從與物體等距離的位置放入裝置中，背朝物體。使用攝像頭和軟件記錄小鼠在每個(gè)物體上的探索時(shí)間（以嘴或鼻子接觸物體或湊近約2-3厘米范圍為標(biāo)準(zhǔn)）。在5分鐘內(nèi)測量動(dòng)物對每個(gè)物體的探索次數(shù)、時(shí)間和距離。 4.第3階段，測試期：通常在第2階段完成后的1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行記憶測試，以評估小鼠的記憶能力（當(dāng)然，也可以選擇更長的時(shí)間間隔來評價(jià)記憶改善效果）。將兩個(gè)相同物體中的一個(gè)替換為一個(gè)不同的物體（標(biāo)記為AC或BC），同樣將小鼠從與物體等距離的位置放入裝置中進(jìn)行5分鐘的測試。
06 數(shù)據(jù)分析
1. 在訓(xùn)練（T1）和測試（T2）階段，記錄每個(gè)會(huì)話中對兩個(gè)物體的總探索時(shí)間（e1和e2）。大多數(shù)小鼠在5分鐘內(nèi)預(yù)計(jì)達(dá)到對兩個(gè)物體的最低探測時(shí)間為20秒。 2. 對于那些探索性行為較低且未達(dá)到最低標(biāo)準(zhǔn)的小鼠品系，可將T1和T2的時(shí)間延長至10分鐘，并額外增加5分鐘，根據(jù)試點(diǎn)測試的觀察結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 3. 行為評分應(yīng)持續(xù)觀察5分鐘或更長時(shí)間，直到達(dá)到20秒的最低標(biāo)準(zhǔn)為止。 4. 若小鼠在10分鐘內(nèi)未能在T1或T2中對兩個(gè)物體的探索達(dá)到最低標(biāo)準(zhǔn)的20秒，應(yīng)將其排除在數(shù)據(jù)分析之外。因?yàn)闊o法確認(rèn)它們是否花費(fèi)了足夠的時(shí)間來學(xué)習(xí)或辨別物體。
07 注意事項(xiàng)
1. 物體探究的定義可能因?qū)嶒?yàn)室而異。除了之前提到的定義外，有些實(shí)驗(yàn)室將物體探究定義為動(dòng)物用鼻子嗅或接觸物體，或者用前肢接觸物體。但通常不將動(dòng)物圍繞物體轉(zhuǎn)圈或坐在物體上的行為計(jì)為物體接觸。 2. 本實(shí)驗(yàn)對環(huán)境要求較高，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜。為了不干擾動(dòng)物的自主行為，最好使用攝像機(jī)監(jiān)控，實(shí)驗(yàn)者在另一房間進(jìn)行觀察。此外，為了避免主觀因素的影響，最好采用盲法觀察，即觀察者不知道所研究動(dòng)物的處理或動(dòng)物的基因類型。 3. 動(dòng)物的氣味會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。因此，在兩動(dòng)物的測試之間應(yīng)該使用酒精清洗物體并清潔敞箱，以避免前一只動(dòng)物遺留的味道對后續(xù)動(dòng)物行為產(chǎn)生誘導(dǎo)。 4. 在訓(xùn)練期間，動(dòng)物對兩個(gè)物體的接觸時(shí)間基本接近。引入一個(gè)新物體后，正常動(dòng)物對新物體的探究會(huì)顯著增加，認(rèn)知系數(shù)高于0.5，達(dá)到0.7-0.8；而當(dāng)動(dòng)物有記憶障礙時(shí)，認(rèn)知系數(shù)仍然在0.5左右，即動(dòng)物對新物體失去偏愛。 5. 物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是腦皮層，尤其是鼻周皮層（perirhinal cortex）依賴的記憶模型。毀損鼻周皮層可阻斷物體認(rèn)知記憶的獲得、再現(xiàn)和鞏固；而毀損海馬則一般不影響物體認(rèn)知行為。