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在醫(yī)學和生命科學領域，免疫組化實驗是一項至關重要的技術，其在疾病診斷、分子生物學研究以及藥物開發(fā)中發(fā)揮著不可替代的作用。 通過利用抗體與特定抗原之間的高度特異性結合，免疫組化實驗能夠精確地定位、定性和定量目標蛋白在組織或細胞中的表達情況。本文將深入探討免疫組化實驗的原理、應用、檢測對象，以及常見的問題和建議。
01 簡介
免疫組化（IHC）是一種在組織或細胞水平上分析特定抗原存在的方法。通過利用高度特異性的抗體與目標抗原結合的原理，它使得我們能夠可視化這些抗原的位置，并對其進行定性和相對定量的研究。這項技術的關鍵步驟包括首先與目標蛋白特異性結合的抗體的應用，然后通過化學手段將這些抗體的位置顯現(xiàn)出來，從而允許我們對組織或細胞中的未知抗原進行定性、定位和相對定量的分析。
02 應用范圍
免疫組化技術在臨床病理學中扮演著至關重要的角色，特別是在處理復雜病例、進行診斷和鑒別診斷方面具有顯著的意義。其應用廣泛，包括但不限于：確診和鑒別腫瘤類型、確定腫瘤原發(fā)位置、深入分析組織的病理學分類、進行組織分類，以及利用免疫組織化學方法通過多種標志物進行軟組織腫瘤的準確診斷，甚至可以發(fā)現(xiàn)微小轉移病灶等。 在科研領域中，免疫組化技術不僅可用于確定組織形態(tài)，還可用于檢測靶標在細胞和亞細胞水平上的定位，以及觀察蛋白質表達的豐度等方面。
03 檢測對象
該技術主要用于處理組織標本，包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）、冰凍切片以及漂片。其中，石蠟切片是免疫組化中最為普遍和基礎的一種，因為它能夠保持組織形態(tài)的完整性，支持連續(xù)切片，有利于進行多指標染色的對照觀察，并能夠長時間保存。 然而，制作石蠟切片的過程中，蛋白質可能因為固定而發(fā)生相互交聯(lián)，從而影響抗原抗體的結合。為減輕這一影響，需要進行抗原修復的步驟。
04 實驗步驟
具體步驟(石蠟切片) 1）、石蠟切片脫蠟至水： 結果分析 正常的結果應該是：鏡下細胞核呈藍色，陽性結果呈深淺不一的棕色。 結果分析的兩種方法是陽性細胞計數(shù)法和評分法。在陽性細胞計數(shù)法中，使用40倍鏡下的光學顯微鏡，在隨機選擇的10個視野下計數(shù)陽性著色細胞的數(shù)量。而評分法則是在光學顯微鏡下，根據(jù)染色程度（0分代表無著色，1分代表淡黃色，2分代表淺褐色，3分代表深褐色）和陽性范圍（1分表示0-25%，2分表示26-50%，3分表示51-75%，4分表示76-100%），對細胞進行評分，并將染色程度和陽性范圍的分數(shù)相加得到最終分數(shù)。 免疫組化結果分析 1）、對照染色：與實驗中設立對照組類似，免疫組化也必須進行對照染色，缺乏對照的結果不可靠。通常包括陽性組織對照、陰性組織對照、陰性試劑對照和自身對照，其中一個陽性組織和一個陰性組織對照足夠。 圖源網絡 4）、圖像分析儀：進行精確定量需要使用圖像分析儀，有多種類型可選擇。推薦一款免費軟件：Image J，該軟件簡潔易用，可滿足一般免疫組化結果分析需求。 圖源網絡
依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液Ⅰ 10min——環(huán)保型脫蠟液Ⅱ 10min——環(huán)保型脫蠟液Ⅲ 10min——無水乙醇Ⅰ 5min——無水乙醇Ⅱ 5min——無水乙醇Ⅲ 5min——蒸餾水洗。
2）、抗原修復：
將切片浸沒在盛滿1×檸檬酸抗原修復液（pH 6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min、?；?min、中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
3）、阻斷內源性過氧化酶：將切片放入3%雙氧 水溶液，室溫避光孵育25min。將玻片置于PBS（PH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4）、畫圈：切片甩干后，組化筆在組織周圍畫圈。
5）、血清封閉：滴加3% BSA牛血清白蛋白，封閉30min。
6）、加一抗：輕輕甩掉封閉液，滴加稀釋好的一抗，平放于濕盒內4℃孵育過夜。
7）、加二抗：將切片浸沒在置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加對應的HRP標記的二抗，室溫孵育50min。
8）、DAB顯色：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)適宜棕黃色陽性，用水沖洗終止顯色。
9）、復染細胞核：將切片放入蘇木素染液復染3min左右，用水沖洗，接著用蘇木素分化液分化數(shù)秒，用水沖洗，最后用蘇木素返藍液進行返藍，用水沖洗。
10）、脫水封片：依次將切片放入無水乙醇Ⅰ5min——無水乙醇Ⅱ 5min——無水乙醇Ⅲ 5min——無水乙醇Ⅳ 5min——環(huán)保型脫蠟液 5min，拿出來晾干，用中性樹膠封片。
2）、定位：抗原表達應在特定部位，例如，LCA應定位在細胞膜上，CK應在細胞漿內，PCNA和p53蛋白應在細胞核內。未在抗原所在部位呈陽性著色不能視為確切陽性結果，可能是非特異性染色或假陽性。若存在不確定性，需使用上述提到的對照染色。
3）、半定量：現(xiàn)今通常使用圖像分析系統(tǒng)進行定量，但如果實驗室條件有限，可使用肉眼進行半定量評估。免疫組化的半定量通常分為三級：弱（+）、中（++）、強（+++）。觀察5-10個高倍視野（HPF），根據(jù)弱（+）=1、中（++）=2、強（+++）=3進行評分。通過計算（+）% × 1 +（++）% × 2 +（+++）% × 3得出數(shù)值，總值<1.0為（+），1.0-1.5為（++），>1.5為（+++）。
05 常見問題及建議
常見的非特異性染色：
1）、抗體問題：一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
2）、抗體濃度過高/孵育時間過長：每次使用新抗體前應該多做預實驗，摸索出最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。
3）、DAB染色時間太長/變質：DAB的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。
4）、內源性酶和生物素：內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶
5）、組織變干：一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣3-4 mm。
6）、浸泡時間過長：切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜。
7）、清洗不充分：清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。
8）、封閉血清問題：原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。