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新聞資訊
腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells，CSCs）的存在對(duì)腫瘤治療和疾病管理提出了挑戰(zhàn)。與普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力和腫瘤形成能力，同時(shí)還表現(xiàn)出對(duì)放化療的抵抗性，這使得它們成為治療策略中的一個(gè)重要目標(biāo)。為了深入研究腫瘤干細(xì)胞的特性和生物學(xué)行為，開發(fā)和應(yīng)用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法至關(guān)重要。腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)是一種常用的方法，通過模擬體內(nèi)的微環(huán)境條件，在體外培養(yǎng)中富集和鑒定腫瘤干細(xì)胞。本文將介紹腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)的原理及其在實(shí)驗(yàn)中的具體步驟。
簡介
腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)是一種用于富集腫瘤干細(xì)胞的方法。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，單個(gè)細(xì)胞被分散在培養(yǎng)皿中，而不是依附于表面。大多數(shù)細(xì)胞因?yàn)闊o法附著而逐漸死亡，但是少數(shù)細(xì)胞可以形成細(xì)胞球體，也就是一團(tuán)細(xì)胞，而且這些細(xì)胞團(tuán)在體外培養(yǎng)時(shí)能夠進(jìn)行多次傳代。研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞球體具有腫瘤干細(xì)胞的特性，當(dāng)移植到動(dòng)物模型中時(shí)，它們能夠生長成腫瘤并連續(xù)多次移植。因此，細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)被廣泛用于富集腫瘤干細(xì)胞。細(xì)胞球的大小和數(shù)量被認(rèn)為是評(píng)估腫瘤細(xì)胞干性的重要標(biāo)志，通常用細(xì)胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）來衡量。
實(shí)驗(yàn)原理
在無血清但富含特定細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件下，腫瘤干細(xì)胞顯示出一項(xiàng)獨(dú)特的能力：它們能夠形成聚集成團(tuán)的克隆腫瘤球，形態(tài)類似于葡萄串。相比之下，普通腫瘤細(xì)胞在這種培養(yǎng)條件下無法有效增殖。這一特性使得在成球培養(yǎng)過程中，腫瘤干細(xì)胞能夠優(yōu)先增殖，從而在群體中占據(jù)主導(dǎo)地位。這種篩選和富集的效應(yīng)有助于從混合細(xì)胞中提取和純化腫瘤干細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
通過觀察細(xì)胞球的大小和數(shù)量，可以評(píng)估細(xì)胞的干性程度。這種評(píng)估主要側(cè)重于單個(gè)細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基條件下自我更新的能力。
實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)所需材料包括： 1. 超低吸附培養(yǎng)皿：可選擇6/12/24孔板，用于細(xì)胞培養(yǎng)。 2. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞需要選擇，例如1640或者DMEM/F12。 3. B27（50X）營養(yǎng)液：含有抗氧化劑、蛋白質(zhì)、維生素和脂肪酸，有助于促進(jìn)細(xì)胞快速增殖，并減少氧化損傷。 4. 重組表皮生長因子（EGF）：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝。 5. 堿性成纖維生長因子（bFGF）：又稱FGF2，有助于保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)。 6. 胰島素（Insulin）：常添加于無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中，維持細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的利用，同時(shí)抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。
實(shí)驗(yàn)步驟
一次成球： 1. 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后離心，去除含血清的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。 2. 用干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F12+1×B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF）重懸細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 3. 細(xì)胞鋪板：選擇超低吸附的六孔板，每孔鋪播N個(gè)細(xì)胞（500-5000個(gè)，根據(jù)細(xì)胞的成球能力），并補(bǔ)加4毫升培養(yǎng)基。 4. 細(xì)胞球培養(yǎng)：使用DMEM/F12培養(yǎng)基，添加20 μl /ml B27、20 ng /ml EGF和20 ng /ml bFGF。將A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以20,000個(gè)/孔的密度種植到六孔板中，每孔2 ml培養(yǎng)液，每隔2～3天換液一次。在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，利用顯微鏡觀察細(xì)胞球的形態(tài)和成長情況。實(shí)驗(yàn)取第3代細(xì)胞球。 5. 大約經(jīng)過10天（不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間可能有所不同）完成培養(yǎng)，觀察細(xì)胞球的狀態(tài)。 二次成球： 1. 收集一次成球得到的細(xì)胞球，離心去上清，用胰酶消化。 2. 加含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心去除含血清的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。 3. 用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 4. 細(xì)胞鋪板：鋪板的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)與一次成球鋪板的細(xì)胞數(shù)量相同。 5. 大約經(jīng)過10天（不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間可能有所不同）完成培養(yǎng)，觀察細(xì)胞球的狀態(tài)。
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