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隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，除了傳統(tǒng)的傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)外，分子病理學(xué)在疾病的診斷、靶向位點(diǎn)篩查和預(yù)后分層等診療全過(guò)程中正扮演著日益關(guān)鍵的角色。在眾多分子病理學(xué)技術(shù)中，熒光原位雜交技術(shù)（FISH）作為其中最基礎(chǔ)且至關(guān)重要的一項(xiàng)，正在發(fā)揮著無(wú)法替代的價(jià)值。那么，FISH技術(shù)究竟是什么？其主要用途和實(shí)驗(yàn)流程又是怎樣的？
簡(jiǎn)介
熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是一種高級(jí)的核酸分子雜交方法。該技術(shù)利用已知的熒光標(biāo)記的單鏈核酸作為探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，通過(guò)經(jīng)歷變性、退火和復(fù)性等過(guò)程，特異性地與待檢樣本中的未知單鏈核酸結(jié)合，形成可以檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。通過(guò)使用熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)熒光信號(hào)，從而能夠檢測(cè)和診斷染色體或基因異常的細(xì)胞和組織樣本。這一技術(shù)為各種基因相關(guān)疾病的分類、預(yù)測(cè)和預(yù)后提供了準(zhǔn)確的依據(jù)。
常見(jiàn)的FISH臨床應(yīng)用有哪些
在實(shí)體腫瘤中應(yīng)用 1.指導(dǎo)靶向藥物的應(yīng)用，例如乳腺癌中的赫賽?。℉ER2）以及肺癌中的克唑替尼（ALK/ROS1/CMET）等，旨在通過(guò)對(duì)分子病理信息的準(zhǔn)確分析，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療方案的制定。 2.用于指導(dǎo)腫瘤的預(yù)后評(píng)估，例如對(duì)于腦膠質(zhì)瘤，通過(guò)檢測(cè)1p和19q的缺失情況，以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤和分化型神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的NMYC表達(dá)等，從而提供對(duì)腫瘤發(fā)展和患者預(yù)后的精準(zhǔn)信息。
在淋巴造血腫瘤中的應(yīng)用 1.通過(guò)分子病理學(xué)技術(shù)明確各種血液腫瘤的診斷，如急性早幼粒白血病中的t(15;17)、慢性粒細(xì)胞白血病中的t(9;22)、套細(xì)胞淋巴瘤中的t(11;14)、Buikitt淋巴瘤中的c-MYC基因重排，以及雙打擊及三打擊淋巴瘤中的MYC、BCL2、BCL6等基因變異。這些特異性分子標(biāo)志物的檢測(cè)為準(zhǔn)確診斷不同血液腫瘤提供了重要依據(jù)。 2.在血液腫瘤領(lǐng)域，對(duì)于急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤等疾病，通過(guò)危險(xiǎn)分層的手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為制定個(gè)性化的治療方案提供有力支持。 3.進(jìn)行染色體隱蔽易位或無(wú)法通過(guò)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的異常的檢測(cè)。 4.對(duì)微小殘留病變進(jìn)行定量分析，同時(shí)評(píng)估大量分裂和非分裂細(xì)胞，以判定細(xì)胞遺傳學(xué)緩解和復(fù)發(fā)情況（其靈敏度相較于實(shí)時(shí)定量PCR較低）。 熒光原位雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用 基因定位是熒光原位雜交的最基礎(chǔ)最成功的應(yīng)用。利用熒光原位雜交靈敏、準(zhǔn)確，并且可以一次檢測(cè)多段基因等特點(diǎn)，可以確定目標(biāo)基因的準(zhǔn)確位置，確定幾個(gè)基因之間的位置關(guān)系，以及基因與染色體端粒之間的關(guān)系，基因與著絲點(diǎn)的關(guān)系，是構(gòu)建基因圖譜的基本要素。目前熒光原位雜交技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于基因的物理定位及基因圖譜的繪制
實(shí)驗(yàn)原理
通過(guò)使用已知的標(biāo)記單鏈核酸作為探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸異性結(jié)合，形成可檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上呈線性排列，這使得探針能夠直接與染色體發(fā)生雜交，從而實(shí)現(xiàn)特定基因在染色體上的定位。
（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）
FISH DNA探針的分類 FISH DNA探針可劃分為位點(diǎn)特異性探針和著絲粒探針，其中位點(diǎn)特異性探針又可細(xì)分為計(jì)數(shù)探針和融合/分離探針。在臨床應(yīng)用中，位點(diǎn)特異性探針目前更為廣泛使用。 計(jì)數(shù)探針采用標(biāo)記特異性DNA片段的方式，通過(guò)計(jì)算信號(hào)數(shù)量來(lái)判斷染色體或基因狀態(tài)的一種標(biāo)記探針。由于正常人的染色體/基因是二倍體，因此正常檢測(cè)信號(hào)數(shù)為兩個(gè)。當(dāng)信號(hào)數(shù)多于兩個(gè)或少于兩個(gè)（排除切片影響）時(shí)，可推斷染色體或基因發(fā)生了異常（擴(kuò)增或缺失）。 擴(kuò)增表現(xiàn) 缺失表現(xiàn) 融合/分離探針在基因發(fā)生重排時(shí)，會(huì)在相對(duì)穩(wěn)定的位置發(fā)生斷裂。該探針利用不同顏色的熒光素標(biāo)記斷裂點(diǎn)兩端的特異性DNA片段，通過(guò)觀察信號(hào)點(diǎn)顏色的變化來(lái)判斷是否發(fā)生了融合或分離事件。在基因未發(fā)生重排時(shí)，探針標(biāo)記的紅綠信號(hào)由于相隔距離太近，會(huì)在肉眼觀察下呈現(xiàn)混色（黃色）。當(dāng)發(fā)生斷裂時(shí)，形成獨(dú)立的顏色信號(hào)（單獨(dú)的紅色或綠色）。當(dāng)然，結(jié)構(gòu)探針同樣能夠指示數(shù)目異常，如多倍體情況。 斷裂表現(xiàn) 融合表現(xiàn)
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)用具及材料 1.人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本； 相關(guān)溶液的配制 （1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g 檸檬酸鈉，加水至 1 000 mL（用 10 mol/L NaOH調(diào) pH 至 7.0）。
2.指甲油、甲酰胺、NaCl、檸檬 酸 鈉、氫氧 化鈉、吐溫 20 等；
3.恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400 熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。
（2）去離子甲酰胺（DF）：將 10 g 混合床離子交換樹(shù)脂加入 100 mL 甲酰胺中。電磁攪拌 30 min，用 Whatman l 號(hào)濾紙濾。
（3）體積分?jǐn)?shù) 70%甲酰胺/2×SSC：35 mL 甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL 水。
（4）體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2×SSC：100 mL 甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL 水。
（5）體積分?jǐn)?shù) 50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）雜交液：8 μL 體積分?jǐn)?shù) 25%DS，20 μL 20×SSC 混合。（或 40 μL 體積分?jǐn)?shù) 50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O 混合）取上述混合液 50 μL，與 5 μL DF 混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù) 10% DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù) 50% DF。
（7）PI/antifade 溶液
PI 原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為 100 μg/mL，取出 1 mL，加 39 mL 雙蒸水，使終濃度為 2.5 μg/mL。Antifade 原液：以 PBS 緩沖液配制該溶液，使其濃度為 10 mg/mL，用 0.5 mmol/L 的 NaHCO3 調(diào) pH 值為 8.0。取上述溶液 1 mL，加 9 mL 甘油，混勻。PI/antifade 溶液：PI 與 antifade 原液按體積比 1:9 比例充分混勻，－20℃保存?zhèn)溆谩?br/>（8）DAPI/antifade 溶液：用去離子水配制 1mL/mg DAPI 儲(chǔ)存液，按體積比 1:300，以antifade 溶液稀釋成工作液。
（9）封閉液 I：體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封閉液 II：體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL 混合。
（11）熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL 混合。
（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至 500 mL，加 Tween20 500 μL。
實(shí)驗(yàn)步驟
探針變性 在75℃的恒溫水浴中，對(duì)探針進(jìn)行溫育5分鐘，然后迅速將其置于0℃，持續(xù)5至10分鐘，以完成雙鏈DNA探針的變性過(guò)程。 標(biāo)本變性 （1）將準(zhǔn)備好的染色體玻片標(biāo)本放置于50℃的培養(yǎng)箱中烤片2至3小時(shí)。（對(duì)經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本，在烤片前需先在固定液中進(jìn)行褪色處理）。 雜交 取已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL滴在已變性且脫水的玻片標(biāo)本上，覆蓋18×18蓋玻片，用Parafilm密封，放置于37℃的濕暗盒中進(jìn)行雜交，持續(xù)過(guò)夜（大約15～17小時(shí)）。由于雜交液較少，溫度相對(duì)較高，而且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，該過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。 洗脫 執(zhí)行此步驟有助于去除非特異性結(jié)合的探針，有效降低背景信號(hào)。 對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針） （1） 在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育 20min。 封片 可以選擇采用不同類型的封片液。如果封片液中未包含Mowiol（這有助于產(chǎn)生自封閉效應(yīng)），為了防止蓋片與載玻片之間的溶液揮發(fā)，可以在蓋玻片周?chē)褂弥讣子瓦M(jìn)行封閉。經(jīng)過(guò)封閉處理的玻片標(biāo)本可在-20℃至-70℃的冰箱內(nèi)的暗盒中保存數(shù)月。 熒光顯微鏡觀察 FISH 結(jié)果 首先，在可見(jiàn)光源下定位顯示細(xì)胞分裂相的視野，然后啟動(dòng)熒光激發(fā)光源，FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。通過(guò)PI染色，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，而由FITC標(biāo)記的探針位置則發(fā)出綠色熒光。
（2）將玻片標(biāo)本取出，浸泡在70～75℃的70%甲酰胺/2×SSC變性液中，進(jìn)行2～3分鐘的變性處理。
（3）立即按照順序?qū)?biāo)本在70%、90%和100%體積分?jǐn)?shù)的冰乙醇中進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度持續(xù)5分鐘，然后進(jìn)行空氣干燥。
（1） 在雜交的第二天，從37℃溫箱中取出標(biāo)本，輕輕使用刀片揭開(kāi)蓋玻片。
（2） 將已完成雜交的玻片標(biāo)本放入預(yù)熱至42～50℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液中，進(jìn)行3次洗滌，每次5分鐘。
（3） 在已升溫至42～50℃的1×SSC中進(jìn)行3次洗滌，每次5分鐘。
（4） 在室溫下，輕輕將玻片標(biāo)本在2×SSC中漂洗一次。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL的復(fù)染溶液（可以是PI/antifade或DAPI/antifade染液），滴在玻片標(biāo)本上，然后蓋上蓋玻片。
（2） 去掉保鮮膜，再加 150 μL avidin-FITC 于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育 40 min。
（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次，每次 5 min。
（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min。
（5） 去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min。
（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的新洗脫液中，洗滌 3 次，每次 5 min。
（7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室溫清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
案例展示
