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新聞資訊
在腫瘤研究領(lǐng)域，幾乎所有從事這一工作的科研人員都對(duì)Transwell實(shí)驗(yàn)了如指掌。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法是一種簡(jiǎn)便而高效的工具，專(zhuān)門(mén)用于深入研究腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移情況。更為重要的是，Transwell實(shí)驗(yàn)不僅可以用于構(gòu)建兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，還可以進(jìn)行趨化性試驗(yàn)，為我們提供了全面了解細(xì)胞行為的機(jī)會(huì)。 本期內(nèi)容，我們將聚焦于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)要介紹Transwell實(shí)驗(yàn)的原理和目的，深入了解如何有效地進(jìn)行這一關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。
簡(jiǎn)介
細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在外部信號(hào)的驅(qū)動(dòng)下，從一個(gè)特定位置遷移到另一個(gè)位置的復(fù)雜生物過(guò)程。在生物體內(nèi)，這一過(guò)程在多個(gè)生理和病理學(xué)情境下發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括但不限于損傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞的遷移以及組織修復(fù)等生命活動(dòng)。 在腫瘤學(xué)研究中，評(píng)估腫瘤細(xì)胞侵襲性是一項(xiàng)至關(guān)重要的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于評(píng)估與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路、藥物治療、靶向治療以及致癌/抑癌基因的效果。因此，在腫瘤研究中，經(jīng)常需要對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行全面的測(cè)試。為此，Transwell實(shí)驗(yàn)被廣泛采用，作為一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，用于精確評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)通過(guò)模擬生理環(huán)境，為研究者提供了獨(dú)特的平臺(tái)，使其能夠深入探究腫瘤細(xì)胞在侵襲性方面的特性和機(jī)制。
基本原理
Transwell實(shí)驗(yàn)，又被稱(chēng)為T(mén)ranswell遷移或侵襲測(cè)定，是一項(xiàng)在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，其主要目的是研究細(xì)胞在多孔膜上的運(yùn)動(dòng)機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)常用于研究細(xì)胞對(duì)各種刺激，如生長(zhǎng)因子、趨化因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分，引發(fā)的遷移、趨化性和侵襲行為。Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)評(píng)估細(xì)胞穿越多孔屏障進(jìn)行遷移或侵襲的能力特別有益，因?yàn)槎嗫灼琳夏M細(xì)胞在體內(nèi)組織的生理?xiàng)l件下的移動(dòng)。 Transwell實(shí)驗(yàn)包括Transwell小室（插入物）和孔板，這是一種由滲透膜隔離的裝置，用于劃分兩個(gè)隔室。通常，頂部室中充滿(mǎn)細(xì)胞，而底部室則含有化學(xué)引誘劑或誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的物質(zhì)。多孔膜允許細(xì)胞通過(guò)膜上的微小孔從頂部室遷移到底部室。 根據(jù)是否在小室內(nèi)添加基質(zhì)膠，Transwell實(shí)驗(yàn)分為兩種類(lèi)型： 遷移測(cè)定（未添加基質(zhì)膠）： 在這種測(cè)定中，細(xì)胞從頂部室遷移到底部室，但無(wú)需降解或侵入膜。這一類(lèi)型的測(cè)定旨在評(píng)估細(xì)胞對(duì)化學(xué)引誘劑梯度的響應(yīng)，展示其移動(dòng)能力。 侵襲測(cè)定（需添加基質(zhì)膠）： 在侵襲測(cè)定中，細(xì)胞不僅通過(guò)多孔膜遷移，還需要通過(guò)通常涂覆在膜頂部的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）層降解或侵襲。例如，侵襲測(cè)定常用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲行為。 作為研究細(xì)胞行為的關(guān)鍵工具，Transwell實(shí)驗(yàn)不僅可以深入了解癌癥轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞遷移和組織發(fā)育等多種生物過(guò)程，還通過(guò)計(jì)算遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)量，或測(cè)量各種細(xì)胞參數(shù)（如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和趨化反應(yīng)）的變化，來(lái)量化細(xì)胞行為。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1.測(cè)定細(xì)胞的遷移能力 2. 測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力 3. 對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力有影響作用的藥物藥效評(píng)價(jià)
材料與儀器
顯微鏡、Transwell 小室、細(xì)胞培養(yǎng)板孔板、無(wú)血清 DMEM、10% 胎牛血清、DMEM 和 1640 培養(yǎng)基、DMEM 完全培養(yǎng)基、
1640 完全培養(yǎng)基（也可加到 20% 血清）、無(wú)菌 PBS、棉簽、胰酶、4% 多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液。
實(shí)驗(yàn)步驟
（一）、基底膜水化前處理： 在進(jìn)行Transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)基底膜進(jìn)行水化處理，以確保適當(dāng)?shù)募?xì)胞遷移環(huán)境。 具體步驟如下： 每個(gè)孔中加入50 μl無(wú)血清培養(yǎng)液，然后在37℃的室溫下進(jìn)行30分鐘的基底膜水化。這個(gè)步驟有助于提供一個(gè)適當(dāng)?shù)幕|(zhì)環(huán)境，為細(xì)胞的遷移和侵襲提供必要的條件。 （二）、細(xì)胞懸液制備： 首先，將細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，去除細(xì)胞周?chē)难逵绊懀ǔＰ枰囸I12～24小時(shí)。 消化細(xì)胞后，通過(guò)離心將培養(yǎng)液去除，并使用PBS洗滌1～2次，確保細(xì)胞的純凈性。 使用含有BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10^5 個(gè)/ml。這一步確保在Transwell小室中接種的細(xì)胞懸液具有適當(dāng)?shù)臐舛取?/span> （三）、細(xì)胞接種： 取100 μl的細(xì)胞懸液，加入Transwell小室中。這一步將細(xì)胞懸液均勻地分布在Transwell小室的頂部。 在孔板的下室中加入600 μl含有10% FBS的培養(yǎng)基。這一步提供了一種引導(dǎo)細(xì)胞遷移的環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)基底膜向下室遷移。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間通常為12～48小時(shí)，主要依據(jù)細(xì)胞的遷移能力而定。這一步允許細(xì)胞逐漸遷移穿過(guò)基底膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞的遷移過(guò)程。 （四）、結(jié)果統(tǒng)計(jì)步驟 一、直接計(jì)數(shù)法 a）“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)： 在這一步驟中，關(guān)注的是細(xì)胞在膜下層黏附的情況，可以通過(guò)染色方式標(biāo)記這些細(xì)胞，例如結(jié)晶紫染色、臺(tái)盼藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色。以下是詳細(xì)的操作步驟： 細(xì)胞固定：小心地取出Transwell小室，吸去上室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭Matrigel和上室內(nèi)的細(xì)胞。然后，在一個(gè)新的24孔板中加入600μL的4%多聚甲醛，將小室放入其中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為20-30分鐘。 細(xì)胞染色：吸去上室內(nèi)的固定液后，將小室移至預(yù)先加入約800μL 0.1%-0.2%結(jié)晶紫染料的孔中，讓細(xì)胞染色15-30分鐘。接下來(lái)，去除未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫，通過(guò)輕輕用棉簽擦拭小室的上側(cè)，去掉那些非特異性地附著在小室上表面的染料，以便在后續(xù)的鏡檢中進(jìn)行計(jì)數(shù)。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：輕輕用清水多次沖洗，將小室取出后，吸干上室內(nèi)的液體。然后，使用濕棉棒小心地擦拭上室底部膜表面上的細(xì)胞。接下來(lái)，小心地使用鑷子將膜揭下，確保底面朝上，然后等待適當(dāng)?shù)臅r(shí)間使其風(fēng)干。將膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，并使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。在高倍顯微鏡下觀(guān)察和拍照，隨機(jī)選擇5個(gè)視野（包括上、下、中央、左、右各一個(gè)），并計(jì)數(shù)呈紫色的陽(yáng)性細(xì)胞，最后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 b）“非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)： 由于細(xì)胞特性或膜的性質(zhì)，有些細(xì)胞在穿過(guò)膜后無(wú)法附著在膜的表面，而是掉入下室。在這種情況下，可以選擇兩種方法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量：一是收集下室內(nèi)的培養(yǎng)液，然后使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)；二是直接在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 二、間接計(jì)數(shù)法 a）MTT法： MTT可以穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)還原為藍(lán)紫色晶體。通過(guò)測(cè)定其光吸收值在490nm波長(zhǎng)下，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。這種方法廣泛用于測(cè)定生物活性因子的活性、篩選抗腫瘤藥物、進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及評(píng)估腫瘤對(duì)放射線(xiàn)的敏感性等。 b）結(jié)晶紫檢測(cè)： 該方法的原理與MTT法相似，通過(guò)在細(xì)胞染色后使用3%醋酸進(jìn)行脫色，然后測(cè)定洗脫液的光密度值（波長(zhǎng)為570nm），間接反映細(xì)胞的數(shù)量。
注意事項(xiàng)
1.在進(jìn)行基底膜鋪膠的過(guò)程中，基質(zhì)膠在室溫下會(huì)迅速凝固，因此整個(gè)過(guò)程需要在冰上進(jìn)行操作，以確保膠液不會(huì)提前凝固。 2.基質(zhì)膠的濃度是影響細(xì)胞遷移和侵襲的重要因素之一。因此，根據(jù)供應(yīng)商提供的信息和具體實(shí)驗(yàn)情況，需要調(diào)整基質(zhì)膠的濃度和稀釋比例。一般常用濃度為1mg/mL。 3.鋪膠時(shí)，建議垂直向小室底部中間加入基質(zhì)膠，以最大程度避免氣泡的產(chǎn)生。 4.吸出小室內(nèi)未結(jié)合的基質(zhì)膠時(shí)，務(wù)必確保移液管的尖端不會(huì)刮傷凝膠層表面，以維持凝膠的完整性。 5.不同細(xì)胞具有不同的遷移和侵襲能力，可以設(shè)置一系列細(xì)胞密度梯度，以尋找適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度。 6.在小室放置過(guò)程中，容易產(chǎn)生氣泡。一旦氣泡產(chǎn)生，下層培養(yǎng)液的趨化作用可能會(huì)減弱或消失。因此，在小室放置過(guò)程中需要格外注意。一旦發(fā)現(xiàn)氣泡，需要及時(shí)提起或使用槍頭去除，然后重新放置。 7.接種細(xì)胞后的1-2小時(shí)內(nèi)，建議對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行檢查，確保沒(méi)有大氣泡產(chǎn)生。盡管有時(shí)可能會(huì)觀(guān)察到極小的氣泡，但它們通常不會(huì)影響細(xì)胞的遷移和侵襲，可通過(guò)輕輕敲擊孔板來(lái)去除。 8.在用PBS清洗小室時(shí)，避免物理觸碰小室底部。可以事先準(zhǔn)備幾個(gè)無(wú)菌燒杯或培養(yǎng)皿，倒入適量PBS，然后依次涮洗，以提高清洗效率。 9.在拍照前，需要適當(dāng)晾干小室，因?yàn)樗謺?huì)影響鏡下視野。確保小室表面干燥，以獲取清晰的圖像。