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在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)是研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵工具。這一精密技術(shù)通過揭示細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)上蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，為深入理解基因調(diào)控、疾病發(fā)生提供了關(guān)鍵信息。然而，ChIP實(shí)驗(yàn)的成功涉及到甲醛交聯(lián)、超聲波斷裂、免疫沉淀等復(fù)雜步驟。本文將深入剖析ChIP實(shí)驗(yàn)內(nèi)部機(jī)制，探討其中的技術(shù)原理和實(shí)驗(yàn)步驟。通過解析這些內(nèi)幕，我們旨在為科研人員提供更深入的理解和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，確保他們能夠在這一領(lǐng)域中取得更準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
簡介
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)是一項(xiàng)在表觀遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的方法，能夠迅速揭示蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用。
染色質(zhì)免疫沉淀法（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一項(xiàng)基于抗原抗體反應(yīng)的技術(shù)，通過特異性相互作用，有選擇性地富集DNA結(jié)合蛋白及其DNA靶標(biāo)。該方法用于在全基因組水平研究生物體組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
技術(shù)原理
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)中，采用生理?xiàng)l件下的方法，通過將細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)，接著利用超聲或酶處理將染色質(zhì)切割成小片段。接下來，通過抗原抗體的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)將與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段沉淀。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定、染色質(zhì)斷裂、染色質(zhì)免疫沉淀、反轉(zhuǎn)交聯(lián)、DNA純化以及DNA鑒定等關(guān)鍵步驟。由于CHIP實(shí)驗(yàn)包含多個(gè)步驟，其結(jié)果的可重復(fù)性相對(duì)較低，因此需要在每個(gè)步驟中引入相應(yīng)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有經(jīng)驗(yàn)的分析。這有助于確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。
研究意義
核酸和蛋白質(zhì)是組成生物體的主要生物大分子，它們之間的相互作用在維持生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，涵蓋了生長、繁殖、運(yùn)動(dòng)、遺傳和代謝等重要生命過程。深入研究蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用對(duì)于揭示生命現(xiàn)象的奧秘至關(guān)重要。CHIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)作為一項(xiàng)重要的工具，有助于探索蛋白質(zhì)與核酸之間復(fù)雜而精密的互作關(guān)系，為理解生物體內(nèi)分子層面的調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵信息。這種實(shí)驗(yàn)方法在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義，為深入解析細(xì)胞內(nèi)生物分子相互作用提供了突破口。
實(shí)驗(yàn)材料
器材：靜音混合器、高速低溫離心機(jī)、超聲破碎儀、電泳儀、水平電泳槽、PCR儀、Real-time PCR儀
試劑：HeLa細(xì)胞、HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、SDS、NaHCO3、去氧膽酸鈉、EDTA、Tris、蛋白酶抑制劑、蛋白酶 K、Protein A／Gbeads（鮭精DNA）、對(duì)照引物（GAPDH）、陽性對(duì)照抗體［乙?；M蛋白H3抗體（Anti-Acetyl HistoneH3）］、陰性對(duì)照抗體［正常家兔IgG（Normal IgG）］、瓊脂糖、PCR反應(yīng) Mix、SYBR Green qPCR Mix
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)步驟基本過程可分為如下幾步： （一）試劑配制 （1）裂解（FA Lysis）緩沖液 50 mmol／L HEPES-KOH,pH 7.5;140 mmol/L NaCl; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1％ Triton X-100；0.1％ 去氧膽酸鈉；0.1％ SDS；蛋白酶抑制劑（臨用前加入）。 （二）細(xì)胞固定 （1）取一個(gè)直徑為150毫米的培養(yǎng)皿，其中細(xì)胞的匯合度約為80%至90%（例如HeLa細(xì)胞數(shù)量約為1x107個(gè)）。在培養(yǎng)皿中加入20毫升培養(yǎng)基，然后添加550微升37%甲醛（或1100微升18.5%甲醛），以使甲醛的最終濃度達(dá)到1%。 （三）染色質(zhì)斷裂 （1）將含有細(xì)胞裂解液的離心管放置在冰上，并進(jìn)行超聲破碎。超聲功率設(shè)定為310瓦，進(jìn)行20秒的沖擊，間隔2秒，總共進(jìn)行3次超聲處理。具體的超聲條件可能會(huì)因不同的細(xì)胞系和細(xì)胞數(shù)量而有所變化，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)摸索來確定。在超聲處理過程中，超聲探頭應(yīng)盡量深入管中，但不要接觸到管底或側(cè)壁，以防止產(chǎn)生泡沫。 （2）超聲破碎后，10000 g、4 ℃，離心10 min，去除細(xì)胞碎片等不溶物質(zhì)。 （4）取100微升超聲破碎后的產(chǎn)物，加入5微升蛋白酶K（濃度為20毫克/毫升），在65攝氏度條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)混合，并解除交聯(lián)，持續(xù)4至5小時(shí)（或過夜）。隨后，將一半樣品進(jìn)行酚-氯 仿抽提處理，以便進(jìn)行后續(xù)的處理。最終，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)超聲效果。 （四）染色質(zhì)免疫沉淀 （1）將每管50微升的超聲破碎產(chǎn)物稀釋至1:10的比例，加入450微升RIPA緩沖液。從中留取5微升（占1%體積）作為Input對(duì)照，并將其保存在4攝氏度，以供后續(xù)步驟（第4步操作）使用。 （五）解交聯(lián)反應(yīng)和DNA的純化 利用蛋白酶K，在65攝氏度條件下保溫4至5小時(shí)，進(jìn)行解除交聯(lián)。接著，通過DNA純化柱回收DNA，或者選擇酚-氯 仿抽提的方法，隨后通過乙醇沉淀進(jìn)行DNA的純化。 （六）DNA的鑒定 最常用的DNA鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。 （七）實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 （1）交聯(lián)后的染色質(zhì)經(jīng)超聲波斷裂，2％ 瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，打斷后的染色質(zhì)片段的平均長度應(yīng)該在200～1000 bp左右。
（2）RIPA緩沖液 50 mmol／L Tris-HCI，pH 8.0；150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA,pH 8.0;1% NP- 40；0.5％ 去氧膽酸鈉；0.1％ SDS；蛋白酶抑制劑（臨用前加入）。
（3）漂洗（Wash）緩沖液 0.1％ SDS；1％ TritonX-100;2 mmol/L EDTA，pH 8.0;150 mmol/L NaCl; 20 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0。
（4）最終漂洗（Final Wash）緩沖液 0.1％ SDS；1% Triton X-100;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;500 mmol/L NaCl;20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
（2）溫和混勻，室溫孵育10 min。
（3）終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為125 mmol／L，溫和混勻，室溫孵育5 min。
（4）將平皿置于冰上。
（5）吸盡培養(yǎng)基，用20 ml冰冷的PBS清洗細(xì)胞。
（6）吸盡PBS，重復(fù)清洗細(xì)胞1次。
（7）加入2 ml冰冷的PBS（含有1x蛋白酶抑制劑復(fù)合物），用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，于1.5 ml離心管中。
（8）1000 g、4 ℃，離心5 min。
（9）吸去上清液，加入750 μl FA Lysis緩沖液，重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液。
（3）吸取上清液分裝至新1.5 ml離心管中，每管50 μl（可于-80 ℃保存3個(gè)月）。
（2）在每個(gè)樣品管中分別加入陽性對(duì)照抗體、陰性對(duì)照抗體（正常IgG）以及目標(biāo)蛋白抗體，抗體的用量范圍為1至10微克。根據(jù)抗體的效力、純度和特異性，通過梯度稀釋抗體，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定 最適合的抗體用量。
（3）加入20 μl充分混勻的 Protein A／G beads（Salmon Sperm DNA）。
（4）4 ℃，旋轉(zhuǎn)混合，1 h或過夜。
（5）2000 g，離心1 min，棄去上清液。
（6）清洗beads 3次，每次用1 ml Wash緩沖液，2000 g離心1 min，棄去上清液。
（7）清洗beads 1次，用1 ml Final Wash緩沖液，2000 g離心1 min，棄去上清液。
（1）每份樣品中均加入120 μl Elution 緩沖液（包括Input對(duì)照組），30 ℃，旋轉(zhuǎn)混合，15 min。
（2）2000 g離心1 min。
（3）吸取上清液至一新的離心管中，可于-20 ℃保存。
（4）加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋轉(zhuǎn)混勻，解交聯(lián)4～5 h（或過夜）。
（5）DNA用酚-氯 仿抽提，乙醇沉淀，加100 μl水溶解DNA，可于-20 ℃保存。
（2）純化后得到的DNA片段經(jīng)PCR分析，擴(kuò)增片段為管家基因GAPDH的啟動(dòng)子區(qū)，片段大小165 bp，陽性對(duì)照和Input對(duì)照可見擴(kuò)增產(chǎn)物，無DNA模板PCR對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照可見微弱擴(kuò)增 條帶，但與陽性對(duì)照比較差別明顯。
注意事項(xiàng)
（1）為了確定甲醛交聯(lián)的反應(yīng)時(shí)間，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵诓煌?xì)胞類型和數(shù)量下，甲醛交聯(lián)的效果會(huì)有所不同。過長的交聯(lián)時(shí)間可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)材料丟失，而且超聲打斷可能難以有效進(jìn)行；而過短的交聯(lián)時(shí)間則可能導(dǎo)致不完全的交聯(lián)。 （2）超聲波是通過機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或泡沫產(chǎn)生，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。在進(jìn)行超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，應(yīng)在冰上進(jìn)行，并設(shè)計(jì)斷續(xù)的超聲程序，避免過長的超聲時(shí)間，以免蛋白質(zhì)降解。 （3）在ChIP實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)照至關(guān)重要，缺少對(duì)照會(huì)使得難以評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。陽性抗體和陰性抗體對(duì)照是最基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。同時(shí)，進(jìn)行充分的Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂效果，還能根據(jù)Input中靶序列的含量和染色質(zhì)沉淀中靶序列的含量，按照取樣比例計(jì)算ChIP的效率。 （4）選擇染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中使用的目的蛋白抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。由于蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能與結(jié)合位點(diǎn)過近，無法被抗體識(shí)別，從而影響免疫沉淀復(fù)合物在體內(nèi)有效形成。 因此，并非所有抗體都適用于ChIP實(shí)驗(yàn)，只有經(jīng)過ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。