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細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，作為細(xì)胞生物學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)之一，不僅在學(xué)術(shù)研究中有著廣泛應(yīng)用，更在藥物篩選、癌癥研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。通過此實(shí)驗(yàn)，我們能夠深入了解細(xì)胞的增殖能力、侵襲性，以及對(duì)不同治療因素的敏感性，為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的創(chuàng)新提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本期文章，我們將深度解析平板克隆和軟瓊脂克隆這兩種常用實(shí)驗(yàn)方法，揭示它們的原理、實(shí)驗(yàn)步驟以及注意事項(xiàng)！
實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)作為一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，以評(píng)估細(xì)胞的增殖、侵襲性和對(duì)殺傷因素的敏感性等生物特性。在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在離體條件下經(jīng)過連續(xù)6代以上的增殖時(shí)，其后代將形成一個(gè)集體，通常被稱為細(xì)胞集落或克隆。細(xì)胞克隆形成率是一個(gè)衡量指標(biāo)，表示細(xì)胞在接種后能夠存活并形成克隆的數(shù)量，即成功貼壁并展現(xiàn)增殖活力的細(xì)胞比例。
并非所有貼壁的細(xì)胞都能成功增殖和形成克隆，而只有那些成功貼壁并具備增殖活力的細(xì)胞才能成功形成克隆。因此，克隆形成率反映了細(xì)胞群體的依賴性和增殖能力這兩個(gè)重要特性，為生物學(xué)研究提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。
克隆形成的目的
通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，我們能夠評(píng)估細(xì)胞在處理后的增殖能力，具體表現(xiàn)為觀察處理后的細(xì)胞在培養(yǎng)板上形成克隆的能力。這一實(shí)驗(yàn)不僅能夠提供對(duì)細(xì)胞增殖能力的直觀量化，還有助于評(píng)估不同殺傷因素（如藥物或基因）對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力和群體依賴性的敏感性。
該實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)重要應(yīng)用是評(píng)估細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤的潛力。并非所有癌細(xì)胞都具備在體內(nèi)形成腫瘤的能力，但如果細(xì)胞在離體條件下表現(xiàn)出強(qiáng)大的克隆形成能力，這可能提示它們?cè)隗w內(nèi)形成腫瘤的潛力較大。因此，這種實(shí)驗(yàn)可以被視為一種模擬體內(nèi)腫瘤形成的離體實(shí)驗(yàn)，為研究腫瘤生物學(xué)提供了有益的信息。
克隆形成的方法
細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)可根據(jù)所采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同分為兩種主要類型：平板克隆和軟瓊脂克隆。
（1）平板克隆形成（Colony Formation on Solid Media）：
這一方法涉及將細(xì)胞培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，通常適用于那些具有貼壁生長特性的細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠附著在培養(yǎng)基表面。在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞形成的克隆被定量測(cè)定，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。
（2）軟瓊脂克隆形成（Soft Agar Colony Formation）：
這一技術(shù)涉及將細(xì)胞混合到瓊脂糖中，使得細(xì)胞在瓊脂糖中懸浮，而不是附著在培養(yǎng)基表面。軟瓊脂克隆形成主要應(yīng)用于研究懸浮生長的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。通過這種方法，我們能夠評(píng)估細(xì)胞在三維環(huán)境中形成克隆的能力，從而更全面地了解其增殖和侵襲特性。
下文將詳細(xì)探討這兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的具體操作步驟，以便更深入地理解它們?cè)谏飳W(xué)研究中的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)過程
1
平板克隆實(shí)驗(yàn)過程
材料：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(根據(jù)細(xì)胞選擇適用種類)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染液、 Giemsa染液 。
實(shí)驗(yàn)步驟：
（1）6孔板
1.將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清)重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
2.細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔(根據(jù)細(xì)胞生長情況確定，一般為700個(gè)細(xì)胞/孔)。
3.繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。
4.克隆完成后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次。
5.每孔加入結(jié)晶紫染液1ml，染細(xì)胞10-20 min。
6.PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照(分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照)。
克隆形成原始圖片（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
注意事項(xiàng)：
1.每隔3天進(jìn)行換液，在換液時(shí)，緩慢加入培養(yǎng)基，避免吹起細(xì)胞。
2.染色完成后，務(wù)必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。
（2）平皿
1.取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清)中備用。
2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組5個(gè)平行樣。每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。
3.置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
4.當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。
5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。
6.去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘。
7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。
DU145細(xì)胞克隆形成的圖片（相機(jī)左，顯微鏡右）
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
注意事項(xiàng)：
1.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)是一種容易操作的方法，特別適用于那些貼壁生長的細(xì)胞。這種實(shí)驗(yàn)通常在玻璃底或塑料培養(yǎng)皿上進(jìn)行。
2.實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵成功因素在于細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞懸液必須確保細(xì)胞均勻分散，不能有細(xì)胞團(tuán)，而且接種密度不應(yīng)過高。
數(shù)據(jù)分析：
使用顯微鏡觀察陽性克隆，即每個(gè)克隆包含超過50個(gè)細(xì)胞，然后使用相機(jī)拍照記錄。隨后，進(jìn)行克隆數(shù)量的計(jì)算，這些克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之間，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)克隆的大小。
例如，在研究某個(gè)基因?qū)?xì)胞增殖的影響，如敲低前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3的TCTN1基因，可以使用顯微鏡拍攝圖像（比例尺為250微米），然后使用相機(jī)拍攝照片。結(jié)果顯示，TCTN1基因的敲低抑制了克隆的形成，減小了克隆的數(shù)量和大小。
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
2
軟瓊脂克隆形成
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，又被稱為非錨定依賴性生長實(shí)驗(yàn)（Anchorage-independent assay），利用軟瓊脂作為培養(yǎng)介質(zhì)，推動(dòng)細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行生長。某些惡性腫瘤細(xì)胞不僅在貼壁狀態(tài)下能夠增殖，而且在懸浮狀態(tài)下同樣能夠展現(xiàn)增殖能力。這種通過在軟瓊脂中形成克隆的能力能夠有效反映細(xì)胞的惡性程度。
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)不僅可用于深入研究細(xì)胞分化的基本原理，同時(shí)也為評(píng)估臨床腫瘤治療的療效提供了有力工具。在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，該實(shí)驗(yàn)發(fā)揮著重要的作用，為我們更全面地理解細(xì)胞行為、腫瘤發(fā)展機(jī)制以及潛在治療策略的效果提供了關(guān)鍵信息。
具體過程如下圖所示：
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
1.配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會(huì)凝固。
2.將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固。
3.將制備好的單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次。
4.根據(jù)細(xì)胞的生長速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色，37°C過夜，拍照。
5. 數(shù)據(jù)分析：顯微鏡或相機(jī)拍照，計(jì)算克隆形成率。
例：通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ME2蛋白對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GBM8401中將ME2蛋白敲低，形成的克隆數(shù)減少。
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
注意事項(xiàng)：
1.在培養(yǎng)皿中涂覆上層的軟瓊脂，以確保細(xì)胞分散成單個(gè)狀態(tài)；接下來，涂抹下層的軟瓊脂，起到支撐作用，以防止細(xì)胞附著并生長。最后，涂覆一層培養(yǎng)基，以防止瓊脂干燥，并為細(xì)胞提供所需的養(yǎng)分。如果需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，藥物可以添加到培養(yǎng)基中。
2.上層軟瓊脂中的細(xì)胞數(shù)量會(huì)根據(jù)不同的細(xì)胞類型而有所不同。通常，使用5000個(gè)細(xì)胞/孔作為起始濃度，但可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
3.瓊脂需要在水浴鍋中維持在約42℃左右的溫度。如果溫度太低，瓊脂會(huì)凝固，而如果在制備底層瓊脂時(shí)凝固過快，可能導(dǎo)致不均勻。另一方面，溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受熱而死亡。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中需要操作迅速，以防止局部結(jié)塊的發(fā)生。
結(jié)論：
在選擇細(xì)胞克隆方法時(shí)，至關(guān)重要的是充分考慮實(shí)驗(yàn)對(duì)象和研究目的。平板克隆適用于評(píng)估貼壁腫瘤細(xì)胞的增殖能力和致瘤性，而軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)不僅適用于貼壁細(xì)胞，還能有效檢測(cè)懸浮腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，因此在某些方面具有平板克隆無法替代的優(yōu)勢(shì)。
若只需簡單評(píng)估貼壁細(xì)胞的增殖能力和群體依賴性，選擇平板克隆方法已足夠。然而，若研究需要更全面地涵蓋懸浮細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的特性，那么軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)可能更為適合。因此，在選擇克隆方法時(shí)，需綜合考慮研究深度和范圍，以確保選用的方法與研究目標(biāo)相契合。
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