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今日小編帶大家將深入剖析細(xì)胞調(diào)控領(lǐng)域中的一項重要技術(shù)——TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）檢測方法。這一技術(shù)以其高度精準(zhǔn)的細(xì)胞死亡檢測而著稱，對于揭示細(xì)胞內(nèi)部的分子機(jī)制至關(guān)重要。本文將全面剖析TUNEL檢測技術(shù)的原理、操作流程以及其在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。精湛的科技背后是對生命過程的深刻理解，今天讓我們一起來解鎖TUNEL檢測技術(shù)的專業(yè)精髓！
01 實驗簡介
在細(xì)胞凋亡過程中，染色體DNA的斷裂經(jīng)歷了多個漸進(jìn)的階段。首先，內(nèi)源性核酸水解酶引發(fā)染色體DNA的降解，形成50-300kb的大片段。接著，大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶的作用下，被隨機(jī)切斷，形成180~200bp核小體DNA多聚體。隨后，由于DNA雙鏈斷裂或單鏈缺口，一系列DNA的3’-OH末端可通過脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的介導(dǎo)，與脫氧核糖核苷酸和其他化合物（如熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素）結(jié)合，標(biāo)記在DNA的3'-末端。這一過程被稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，可用于檢測凋亡細(xì)胞。
02 應(yīng)用方面
這一方法可用于檢測凋亡的組織切片，包括經(jīng)過福爾馬林固定并進(jìn)行石蠟包埋的切片、冰凍切片，以及培養(yǎng)或從組織中分離的細(xì)胞。除此之外，該技術(shù)還可廣泛應(yīng)用于評估抗腫瘤藥物的療效。通過采用雙色法，它不僅能夠確定細(xì)胞死亡類型，還能精確判定細(xì)胞所處的分化階段。這使得該技術(shù)成為研究細(xì)胞行為和藥物療效的重要工具，具備廣泛而有力的應(yīng)用前景。
03 實驗材料 組織切片 冰凍切片 細(xì)胞 磷酸緩沖液 蛋白酶K 氯化估鹽 蒸餾水 H2 O2 二氨 基聯(lián) 苯 丁醇 乙醇 二甲本 甲醛
乙酸 松香水 抗第高 辛抗體 氯化鈉 檸檬酸鈉 乙酸鈉 甲基綠 TdT酶反應(yīng)液 光學(xué)顯微鏡 染色缸 載玻片 蓋玻片
04 實驗步驟
1. 標(biāo)本預(yù)處理
（1）對石蠟包埋的組織切片進(jìn)行預(yù)處理的步驟如下：首先，將組織切片放置在染色缸中，通過二甲本進(jìn)行兩次5分鐘的洗滌。接著，使用無水乙醇進(jìn)行兩次3分鐘的洗滌，隨后使用95%和75%乙醇各進(jìn)行一次3分鐘的洗滌。然后，使用PBS進(jìn)行5分鐘的洗滌，隨后加入蛋白酶K溶液（濃度為20 ug/ml），在室溫下進(jìn)行15分鐘的水解，以去除組織中的蛋白質(zhì)。最后，使用蒸餾水進(jìn)行4次2分鐘的洗滌，然后按照步驟2進(jìn)行后續(xù)操作。
（2）對冰凍組織切片進(jìn)行預(yù)處理的步驟如下：首先，將冰凍組織切片放置在10%中性甲醛中，在室溫下進(jìn)行10分鐘的固定，然后去除多余液體。接著，使用PBS進(jìn)行兩次5分鐘的洗滌。將組織切片置于乙醇和乙酸（比例為2：1）的溶液中，在-20℃處理5分鐘，然后去除多余液體。再次使用PBS進(jìn)行兩次5分鐘的洗滌，隨后按照步驟2進(jìn)行后續(xù)操作。
（3）對培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理的步驟如下：首先，將濃度為約5 × 10^7個/ml的細(xì)胞置于4%中性甲醛中，在室溫下進(jìn)行10分鐘的固定。然后，在載玻片上滴加50-100 μl的細(xì)胞懸液，并使其干燥。接著，使用PBS進(jìn)行兩次5分鐘的洗滌，隨后按照步驟2進(jìn)行后續(xù)操作。
2. 色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5 min。用PBS洗兩次，每次5 min。
3. 用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1-5 min。
4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1 h（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。
5. 將切片放入染色缸中，然后加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液。在37℃下保溫30分鐘，每隔10分鐘輕輕提起和放下載玻片一次，以輕微攪動液體。
6. 對組織切片進(jìn)行處理的步驟如下：先使用PBS進(jìn)行3次5分鐘的洗滌，然后直接在切片上滴加兩滴標(biāo)有過氧化物酶的抗第高 辛抗體。在濕盒中，讓其在室溫下反應(yīng)30分鐘。
7. 用PBS洗4次，每次5 min。
8. 在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05% DAB溶液，室溫顯色3-6 min。
9. 用蒸餾水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min。
10. 在室溫下，使用甲基綠進(jìn)行10分鐘的復(fù)染。隨后，進(jìn)行3次蒸餾水洗滌，前兩次每次提起放下載玻片10次，最后一次靜置30秒。然后，以相同的方式使用100%正 丁醇進(jìn)行三次洗滌。
11. 用二甲本脫水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。
實驗流程（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
05 案例展示
（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
06 注意事項
1. 必須建立陽性和陰性細(xì)胞對照。
2. 作為陽性對照的切片可以采用部分被DNaseI降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對照則可使用經(jīng)過地塞米松（1 μM）處理3-4小時的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。
3. 陰性對照中不添加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。
07 常見問題
一、出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記 4、碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。
1、有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。
解決方法是：取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
2、使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ?，?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。
解決方法： 建議采用推薦的固定液。
3、TUNEL檢測反應(yīng)時間過長，或TUNEL檢測反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。
解決方法：注意控制反應(yīng)時間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
二、熒光背景很高
1、支原體污染。
解決方法：請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
2、高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
3、TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)。
解決方法：可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
4、紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。
解決方法： 此時宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。
三、標(biāo)記效率低
1、使用乙醇或甲醇固定會導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
2、固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。
解決方法：此時宜減少固定時間。
3、熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴(yán)重淬滅。
解決方法：需注意避光操作。
解決方法：用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
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