首頁(yè)
新聞資訊
01 簡(jiǎn)介
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的基本原理是從組織或細(xì)胞中提取總RNA，將其中的mRNA作為模板，并利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。隨后，以這些合成的cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，從而得到所需的基因或用于檢測(cè)基因表達(dá)的產(chǎn)物。
RT-PCR通過提升RNA檢測(cè)的敏感性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微量RNA樣品的高效分析。該技術(shù)的主要應(yīng)用包括：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目標(biāo)基因、合成cDNA探針，以及構(gòu)建具有高效轉(zhuǎn)錄能力的RNA系統(tǒng)。
兩步法：先RT，再PCR（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
一步法：在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，RT和PCR同時(shí)進(jìn)行 （圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
02 反轉(zhuǎn)錄酶的選擇: 1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出強(qiáng)大的聚合酶活性，而其RNA酶H活性相對(duì)較為有限。其最適操作溫度為37℃。
2、禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)出卓越的聚合酶活性和RNA酶H活性，其最適操作溫度為42℃。
3、嗜熱微生物，如Thermus thermophilus和Thermus flavus，產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶在Mn2+存在下表現(xiàn)出高溫下反轉(zhuǎn)錄RNA的能力，有助于消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
4、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體，以Superscript和SuperScriptⅡ?yàn)樯唐访?。這種酶相較于其他同類酶更能有效地將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換為cDNA。這一特性使得在含有二級(jí)結(jié)構(gòu)、難以進(jìn)行低溫反轉(zhuǎn)錄的mRNA模板中，能夠合成更長(zhǎng)的cDNA。
03 合成cDNA引物的選擇
1、隨機(jī)六聚體引物具有不特異性，用于在特定mRNA因含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以復(fù)制其全長(zhǎng)序列的情況下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用這種引物的方法中，體系中的所有RNA分子都作為cDNA的第一鏈模板，而PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需的特異性。通常，通過這種引物合成的cDNA中，有96%來自rRNA。
2、Oligo(dT)是一種特異于mRNA的策略。由于大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3'端具有Poly(A+)尾，Oligo(dT)與之配對(duì)，只有mRNA才能被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，因此使用這種引物合成的cDNA相比使用隨機(jī)六聚體引物，得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面都較小。
3、特異性引物采用含有目標(biāo)RNA互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，這是引發(fā)最為特異反應(yīng)的一種方法。在PCR反應(yīng)中，如果使用兩個(gè)特異性引物，第一條鏈的合成可以由與mRNA 3'端最靠近的引物起始。通過這種引物，只產(chǎn)生所需的cDNA，從而導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。
04 實(shí)驗(yàn)操作
一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器：
組織 細(xì)胞。
RNA提取試劑、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一鏈cDNA合成試劑盒。
離心管、離心機(jī)、水浴鍋、PCR管、電泳儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)、移液管、移液槍、離心管盒。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
（1）、總RNA的提取：見 總RNA的提取 相關(guān)內(nèi)容。
（2）、cDNA第一鏈的合成
目前市面上有多家生物試劑公司提供各種cDNA第一鏈試劑盒，它們的基本原理相似，但具體的操作步驟可能有所不同。以下以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒為例說明。
1、在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 ug，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，輕輕混勻、離心；
2、70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；
3、取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 ul；上游引物（10 pM） 2 ul；下游引物（10 pM） 2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul） 1 ul。輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5 min；
4、加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；
5、于70℃加熱15 min以終止反應(yīng)；
6、將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
（3）、PCR
1、取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；
2、加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50 ul。輕輕混勻，離心；
3、設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照；
4、電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果；
5、密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。
05 注意事項(xiàng)
1、在實(shí)驗(yàn)過程中，需采取措施防止RNA的降解，以保持RNA的完整性。在進(jìn)行總RNA提取時(shí)，特別需注意避免mRNA的斷裂； 2、為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；
3、內(nèi)參的設(shè)定主要用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參包括G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免由于RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一和不同孔間溫度差異等引起的誤差；
4、PCR反應(yīng)出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA的起始數(shù)量有關(guān)，因此不能確定PCR反應(yīng)何時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。為了確定每個(gè)目標(biāo)序列的平臺(tái)效應(yīng)循環(huán)數(shù)，需要進(jìn)行單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)；
5、為了防止DNA的污染，可以采用DNA酶處理RNA的方法。在可能的情況下，建議將PCR引物放置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。