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新聞資訊
01
簡(jiǎn)介
經(jīng)過(guò)包埋的組織在普通玻片上進(jìn)行切片后，可以使用HE染色，這種方法通過(guò)區(qū)分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的酸堿性特性，將它們?nèi)境商焖{(lán)和玫紅兩種鮮艷的顏色，以滿(mǎn)足形態(tài)學(xué)觀(guān)察的需求。如果需要進(jìn)行免疫組化或熒光分析，那么在切片時(shí)需要在玻片上使用粘片劑，以防止在多個(gè)操作步驟中出現(xiàn)掉片的情況。
02
基本原理
HE染色方法之所以廣泛應(yīng)用于細(xì)胞染色領(lǐng)域，是因?yàn)樗诨瘜W(xué)反應(yīng)之外還涉及物理吸附和吸收效應(yīng)，這些效應(yīng)共同促成了HE染色的出色核漿對(duì)比效果。這個(gè)方法利用了蘇木素染色液的堿性屬性，將細(xì)胞染成藍(lán)色，以及伊紅的酸性屬性，將細(xì)胞染成紅色。結(jié)果是，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。這兩種不同的染色液通過(guò)改變細(xì)胞的折射率，使細(xì)胞在光鏡下呈現(xiàn)出不同的顏色，從而呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像。
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03
HE染色實(shí)驗(yàn)材料與儀器
器材：染缸、蓋玻片、組織切片
試劑：① C8H10、② 乙醇、③ 蘇木素染液、④ 蒸餾水、⑤ 中性樹(shù)膠
04
HE染色操作步驟
將已烘干的切片在C8H10中脫蠟 5～10 分鐘，兩次。
移入C8H10和純乙醇（1：1）混合液中 5 分鐘左右（如經(jīng)二次C8H10脫蠟，此步可省略）。
移入 100％、95％、85％、70％ 乙醇中，各級(jí)為 2～5 分鐘。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染色液。
自己配制或商業(yè)化購(gòu)買(mǎi)的蘇木素染液染色 5～15 分鐘。
流水沖洗 15～30 分鐘，或者在 0.75％ 氯化銨溶液中短時(shí)間堿化或藍(lán)化，使細(xì)胞核呈藍(lán)色。
蒸餾水短洗。
依次經(jīng) 70％、85％、95％ 乙醇脫水，各級(jí)為 2～3 分鐘。
0.1％～0.5％ 伊紅染液染色 1～5 分鐘，若著色困難，可在每 100 ml 染液中加入 1～2 滴無(wú)水乙酸，使易著色且不易脫色。
依次快速通過(guò) 95％ 和 100％ 乙醇洗去多余的伊紅染液，在濃度 95％ 以下的乙醇中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短時(shí)間。
C8H10透明（二次），共約 10 分鐘。
封片擦去切片周?chē)嘤郈8H10，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹(shù)膠，再加蓋玻片封固，避免產(chǎn)生氣泡。在通風(fēng)櫥中吹干C8H10，封片穩(wěn)定后轉(zhuǎn)移到片盒中保存。
05
案例展示
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06
注意事項(xiàng)
當(dāng)進(jìn)行免疫組化或熒光分析時(shí)，在切片過(guò)程中需要應(yīng)用粘片劑于玻片，以確保切片在多個(gè)處理步驟中不會(huì)脫落或掉落。
07
常見(jiàn)問(wèn)題
1.切片染色不勻
1.1組織取材固定不當(dāng)。
如組織取材過(guò)大或過(guò)厚，不能將組織完全固定，組織切片染色后出現(xiàn)外周固定好的部分易著色，而中間未固定好的組織，細(xì)胞著色模糊，使染色不均。在送檢的標(biāo)本中，及時(shí)用4%中性甲醛對(duì)標(biāo)本固定，固定液應(yīng)是標(biāo)本的4倍。大標(biāo)本應(yīng)切開(kāi)固定。
1.2切片薄厚不均或有橫紋。
切片刀有缺口時(shí)，易造成斷裂，破碎和不完整；切片刀傾角過(guò)大上卷，不能連在一起，過(guò)小則切片皺起。
或因螺絲松動(dòng)產(chǎn)生振動(dòng)切片易造成厚薄不均或技術(shù)人員手臂搖動(dòng)切片機(jī)頭力量不均易造成橫紋。
切片時(shí)檢查切片機(jī)螺母是否擰緊，切片刀角度是否過(guò)大或過(guò)小即可。
1.3組織脫水，透明和浸臘處理不當(dāng)
（1）組織脫水用的各級(jí)乙醇未能保證相應(yīng)濃度使組織脫水不徹底。
（2）二甲苯內(nèi)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)組織易碎也無(wú)法切出好片子。
（3）浸臘溫度過(guò)高，組織變脆也不利切片染色。
1.4染色過(guò)程處理不當(dāng)
（1）組織切片脫臘不徹底，如二甲苯時(shí)間過(guò)久 ，無(wú)水乙醇不純或時(shí)間過(guò)久，室溫低，組織切片上的石蠟沒(méi)有全部除掉時(shí)，含臘部分不著色或著色過(guò)淺染色液試劑量少，組織切片沒(méi)有全部浸到 。
（2）組織切片上在撈片時(shí)有氣泡，則氣泡內(nèi)組織可能染色不均。
2.切片染色模糊不清
2.1取材：
組織標(biāo)本已發(fā)生自溶或取材后沒(méi)及時(shí)固定或固定液濃度不夠；另固定前干枯標(biāo)本，染色后易出現(xiàn)灰染現(xiàn)象，很難補(bǔ)救。
2.2固定
（1）固定劑對(duì)組織有一定媒染作用，它既可與蛋白結(jié)合又能與染料結(jié)合，可增強(qiáng)著色能力，同時(shí)能沉淀和凝固細(xì)胞內(nèi)成分，使細(xì)胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同折光率造成光學(xué)差異，故固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。
（2）在日常病理制片中淋巴結(jié)處理不當(dāng)造成切片染色后組織見(jiàn)發(fā)灰現(xiàn)象，其主要原因由于細(xì)胞密集，結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致固定液難以滲透到組織深部，從而造成組織中央固定不佳，而出現(xiàn)徹底發(fā)灰現(xiàn)象。可用等量無(wú)水乙醇乙醚混合液處理切片5-10分鐘，乙醇洗，水洗，3%硫酸鐵銨溶液補(bǔ)充媒染5分鐘既可。
（3）送檢標(biāo)本部分用乙醇固定組織，常溫下乙醇的白蛋白，球蛋白不再溶于水，而核蛋白則可溶于水。故乙醇固定標(biāo)本切片，切片染色不良，細(xì)胞質(zhì)染色較差。切片出現(xiàn)模糊不清現(xiàn)象，其補(bǔ)救辦法用4%中性甲醛對(duì)標(biāo)本再固定。
3.其他原因
3.1溫度：
包埋/切片后烤片溫度過(guò)高，均會(huì)使蛋白發(fā)生質(zhì)變可能發(fā)生拒染，造成切片染色模糊不清。
3.2染料：
質(zhì)量差或溶液配制不當(dāng)，如配制蘇木精時(shí)加熱使氧化過(guò)度，不能生成三氧化蘇木紅生成四氧化蘇木紅使染液沒(méi)有染色能力或蘇木精使用時(shí)間過(guò)久，導(dǎo)致切片著色能力或蘇木精使用時(shí)間過(guò)久，導(dǎo)致切片著色不良，切片模糊不清。
3.3分化過(guò)度，細(xì)胞核著色淡
3.4脫水
透明不徹底：切片如在二甲苯中有白霧現(xiàn)象發(fā)生即表示乙醇脫水未盡，應(yīng)立即返回重新脫水。否則，鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。
3.5封固
（1）注意避免封片者口鼻呼出氣接觸組織上封劑，因呼出氣體中會(huì)含水分。
（2）在潮濕環(huán)境中動(dòng)作要快，以免空氣水進(jìn)入封固內(nèi)響質(zhì)量。